Molekulární biologie pro žáky (studenty) i jejich vyučující nezřídka představuje skutečný oříšek. Žáci považují daný celek za abstraktní, pedagogové zase mnohdy zápolí s transformací oborového poznání a volbou námětů na praktickou výuku. Osudovou bariérou bývá také sporé vybavení školních laboratoří či limitace finančními prostředky na potřebné pomůcky.
Jak si s vybranými úskalími poradit, uchopit „molekuláru“ prakticky a zábavně a vydat se se žáky na vzrušující putování do světa (makro)molekul i s nízkonákladovým rozpočtem?
Atraktivní námět s poměrně snadnou implementací nabízí gelová elektroforéza „v levném podání“. Elektroforéza je tradiční a hojně využívanou molekulárně-genetickou metodou, sloužící k separaci a analýze makromolekul, např. proteinů. Princip této separační metody tkví v postupném rozdělení jednotlivých složek směsi dle jejich rozličné hybnosti ve stejnosměrném elektrickém poli. Molekuly se pohybují gelem o různé velikosti pórů v závislosti na molekulové hmotnosti a velikosti elektrického náboje. Své uplatnění elektroforéza nachází v široké škále oblastí včetně rutinní diagnostiky onemocnění, identifikace osob či biotechnologií.
Jak na levnou verzi gelové elektroforézy na příkladu molekul DNA
V rámci laboratorní výuky a praktických cvičení můžeme nákladné vybavení profesionálních laboratoří nahradit tím pro školy snadno dostupným: elektroforetickou vanou spolu se zdrojem elektrického napětí, plastovou krabičkou a 9V bateriemi s elektrodami (sponky s krokosvorkami), sloužícími k sestavení elektrického obvodu. Automatickou pipetu lze substituovat klasickou Pasteurovou, kapátkem či například injekční stříkačkou. Gel pak vybíráme dle typu prováděné elektroforézy – například agar s pufrem pro elektroforézu v agarózovém gelu. Obvykle používaný tris [tris(hydroxymethyl)aminomethan] je možno nahradit kyselinou citrónovou a citrátem sodným třeba ze sladkých nápojů (bližší návod k přípravě v případě potřeby viz Ens a kol.). Elektroforetický hřeben, sloužící k tvorbě jamek, netřeba nahrazovat.
Klíčem k úspěchu je kromě přípravy gelu a jeho odpovídající hustoty také správné zapojení elektrického obvodu a zvládnutá technika při pipetování vzorků. Zdroj elektrického napětí sestavíme z pěti sériově zapojených 9V baterií (celkové napětí 45V). Posléze si (zatím pouze!) rozvrhneme budoucí propojení s krabičkou – elektroforetická vana bude připojena k vytvořenému zdroji napětí tak, aby anoda (kladný náboj) v tomto případě byla umístěna na vzdálenějším konci od jamek a katoda (záporný náboj) na bližším konci. Anoda by přitom měla být vzdálena přibližně 2 cm od okraje vany kvůli oxidaci (viz rovnice dále).
Elektrody (sponky) připevníme krokosvorkami ke hranám vany a zcela ponoříme podél kratších hran do pufru (viz fotografie). Nyní do jamek napipetujeme požadované množství µl (= mikrolitrů, např. 10 µl) vzorků pomocí automatické pipety či její alternativy. Autoři námětu doporučují použití extrahovaných potravinářských barviv ze sladkostí („DNA“). Vzorky pipetujeme vždy ve stejném objemu µl. Následně připojíme elektroforetickou vanu ke zdroji napětí s pomocí krokosvorek a necháme elektroforézu běžet (viz fotografie). Experiment v této fázi zabere asi 20 minut, vhodné je však vyčkat úplného rozdělení barviv. Molekuly se budou pohybovat gelem na různé vzdálenosti o rozdílné rychlosti na základě molekulové hmotnosti a velikosti náboje. Na elektrodách budou probíhat následující reakce:
Anoda: 2 Fe + O2 → 2FeO
2H2O → O2 (g) + 4 H+ + 4e-
Katoda: 2 Zn + O2 → 2 ZnO
2H2O + 2e- → H2 (g) + 2OH-
Vanu závěrem experimentu odpojíme a výsledný produkt můžeme vyhodnotit.
Upozornění: Elektrický obvod by měl být sestavován a připojen ke zdroji elektrického napětí výhradně pod dozorem vyučující/ho. Při pipetování vzorků nikdy nesmí být elektroforetická vana připojena ke zdroji napětí. Jakýkoliv kontakt s vanou v průběhu elektroforézy je nepřípustný!
Gelová elektroforéza „v levném podání“ v sobě skýtá možnost, jak žákům snadno a úsporně přiblížit tuto základní laboratorní metodu, zejména s akcentem na využitelnost v reálném životě. Výuku lze provázat s dalšími jednoduchými (izolace genomové DNA z buněk bukální sliznice) i pokročilými molekulárními metodami (např. restrikční analýza a PCR či ELISA). Žáky můžeme také nechat nahlédnout pod pokličku kriminalistiky, modelovat fiktivní „místo činu“, vyzkoušet si sběr a následný rozbor biologického materiálu či metodu daktyloskopie. Takto pojaté vyučování je ideální živnou půdou pro zařazení problémových úloh či prvků badatelsky orientované výuky.
Námět s tipem do praxe zpracovala v návaznosti na svou diplomovou práci Radka Dočekalová
댓글